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用恒溫培養箱進行枯草桿菌黑色變種芽孢懸液的制備

更新時間:2019-04-11  |  點擊率:1999

      1、以無菌操作方式開啟菌種管,加入適量營養肉湯培養基,吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0mL~10.0mL 營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置 36℃±1℃ 培養 18h~24h。用接種環取第 1 代培養的菌懸液,劃線接種于營養瓊脂培養基平板上,置 36℃±1℃ 培養 18h~24h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落,接種于營養肉湯培養基,置 36℃±1℃ 培養 18h~24h,即為第 3 代培養物。

      2、 用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL~10.0mL 第 3代~5代的 18h~24h 營養肉湯培養物,接種于羅氏瓶營養瓊脂培養基表面,將其搖動使菌液布滿培養基表面,將多余肉湯培養物吸出,羅氏瓶置 36℃±1℃ 恒溫培養箱內培養 5d~7d。

      3、用接種環取少許菌苔涂于玻片上,以改良芽孢染色法染色。改良芽孢染色法:用接種環取菌苔涂于玻片上,自然干燥后,通過火焰加熱將菌固定于玻片上;將涂片放入平皿內,片上放兩層濾紙,滴加足量的 5.0% 孔雀綠水溶液,將平皿蓋好,置恒溫培養箱55℃±1℃加熱 30min。取出,去濾紙,用自來水沖去殘留液;加0.5%沙黃水溶液,1min后水洗,待干后鏡檢。芽孢呈綠色,菌體呈紅色。在顯微鏡(油鏡)下鏡檢,當芽孢形成率達 90% 以上時,即可進行以下處理。否則,繼續在室溫下放置一定時間,直至達到上述芽孢形成率后再進行以下處理。

      4、加 10.0mL 無菌蒸餾水于羅氏瓶中,以 L棒輕輕推刮下菌苔,吸出,再加入 5.0mL 無菌蒸餾水沖洗培養基表面,吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中,振搖 5min。

      5、將燒瓶置 45℃ 水浴 24h,使菌自溶斷鏈,分散成單個芽孢。

      6、用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液,清除瓊脂凝塊。

      7、將芽孢懸液置無菌離心管內,以 3000r/min 速度離心 30min。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗,本步驟重復進行3遍。

      8、 將洗凈的芽孢懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內,80℃水浴10min(或60℃水浴30min),以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后,搖勻分裝后冷藏保存備用,有效使用期6個月。

      9、芽孢懸液在使用時,先進行活菌培養計數。

      10、 懷疑有雜菌污染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑒定。

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